Bruger:Khgdh/Loop-medieret isotermisk amplifikation

Loop-medieret isotermisk amplifikation (LAMP) er en enkelt rørteknik til amplifikation af DNA og et billigt alternativ til at påvise visse sygdomme. Ved loop-medieret isotermisk amplifikation med omvendt transskription (RT-LAMP) kombineres LAMP med et trin med omvendt transskription for at gøre det muligt at påvise RNA.

LAMP er en isotermisk nukleinsyreamplifikationsteknik. I modsætning til polymerasekædereaktionsteknologien (PCR), hvor reaktionen udføres med en række vekslende temperaturtrin eller cyklusser, udføres isotermisk amplifikation ved en konstant temperatur og kræver ikke en termisk cycler.

Teknik

Ved LAMP amplificeres målsekvensen ved en konstant temperatur på 60-65 °C (140-149 °F) ved hjælp af enten to eller tre sæt primere og en polymerase med høj strengforskydningsaktivitet ud over replikationsaktivitet. Typisk anvendes der 4 forskellige primere til at amplificere 6 forskellige regioner på målgenet, hvilket øger specificiteten. Et ekstra par "loop-primere" kan fremskynde reaktionen yderligere. Mængden af DNA, der produceres ved LAMP, er betydeligt større end ved PCR-baseret amplifikation.

Skema over en LAMP af nukleinsyrebiomarkører fra rå ubehandlede spildevandsprøver med henblik på hurtig kvantificering af menneskespecifikt mitokondrie-DNA (mtDNA).

Amplifikationsproduktet kan påvises ved hjælp af fotometri, der måler den turbiditet, der skyldes magnesiumpyrofosfatudfældning i opløsningen som et biprodukt af amplifikationen. Dette giver mulighed for nem visualisering med det blotte øje eller via enkle fotometriske detektionsmetoder for små mængder. Reaktionen kan følges i realtid enten ved at måle turbiditeten eller ved fluorescens ved hjælp af interkalierende farvestoffer som f.eks. SYTO 9. Farvestoffer som f.eks. SYBR green kan anvendes til at skabe en synlig farveændring, der kan ses med det blotte øje uden behov for dyrt udstyr, eller til en reaktion, der kan måles mere nøjagtigt med instrumentering. Farvestofmolekyler interkalerer eller mærker direkte DNA'et og kan til gengæld korreleres med antallet af oprindeligt tilstedeværende kopier. LAMP kan derfor også være kvantitativ.

Det er muligt at påvise LAMP-dna-amplifikation i rør ved hjælp af manganbelastet calcein, som begynder at fluorescere ved kompleksdannelse af mangan med pyrofosfat under in vitro-dna-syntese.

En anden metode til visuel detektion af LAMP-amplikoner med det blotte øje var baseret på deres evne til at hybridisere med komplementært guldbundet ss-DNA og dermed forhindre den normale røde til lilla-blå farveændring, som ellers ville forekomme under saltinduceret aggregering af guldpartiklerne. En LAMP-metode kombineret med amplikondetektion ved hjælp af AuNP kan således have fordele i forhold til andre metoder med hensyn til reduceret analysetid, amplikonbekræftelse ved hybridisering og brug af enklere udstyr (dvs. intet behov for en termocycler, elektroforeseudstyr eller en UV-trans-illuminator).

Anvendelse og fordele

LAMP er en relativt ny DNA-amplifikationsteknik, som på grund af sin enkelhed, robusthed og lave pris kan give store fordele. LAMP har potentiale til at blive anvendt som en simpel screeningsundersøgelse i marken eller på behandlingsstedet af klinikere. Da LAMP er isotermisk, hvilket eliminerer behovet for dyre termocyklere, der anvendes i konventionel PCR, kan det være en særlig nyttig metode til diagnosticering af smitsomme sygdomme i lav- og mellemindkomstlande. LAMP undersøges i vid udstrækning til påvisning af smitsomme sygdomme som f.eks. filariasis, zikavirus, tuberkulose, malaria, sovesyge og SARS-CoV-2. I udviklingslandene er det endnu ikke blevet grundigt valideret for andre almindelige patogener.

LAMP er blevet observeret som mindre følsom (mere modstandsdygtig) end PCR over for inhibitorer i komplekse prøver som f.eks. blod, hvilket sandsynligvis skyldes brugen af en anden DNA-polymerase (typisk Bst - Bacillus stearothermophilus - DNA-polymerase i stedet for Taq-polymerase som i PCR). Flere rapporter beskriver vellykket påvisning af patogener fra minimalt behandlede prøver, f.eks. varmebehandlet blod, eller i tilstedeværelse af kliniske prømmatricer. Denne egenskab ved LAMP kan være nyttig i miljøer med få ressourcer eller i feltsituationer, hvor en konventionel DNA- eller RNA-ekstraktion forud for diagnostisk testning kan være upraktisk.

Begrænsninger

LAMP er mindre alsidig end PCR, som er den mest veletablerede nukleinsyreamplifikationsteknik. LAMP er primært nyttig som en diagnostisk eller påvisningsteknik, men er ikke nyttig til kloning eller mange andre molekylærbiologiske anvendelser, som PCR gør det muligt at anvende. Da LAMP anvender 4 (eller 6) primere, der er rettet mod 6 (eller 8) regioner inden for et forholdsvis lille segment af genomet, og da primerdesignet er underlagt mange begrænsninger, er det vanskeligt at designe primersæt til LAMP "efter øjemål". Der anvendes generelt gratis, open source- eller kommercielle softwarepakker til at hjælpe med at designe LAMP-primere, selv om begrænsningerne i forbindelse med primerdesignet betyder, at der er mindre frihed til at vælge målsted end ved PCR.

I en diagnostisk anvendelse skal dette afvejes mod behovet for at vælge et passende mål (f.eks. et bevaret sted i et meget variabelt viralt genom eller et mål, der er specifikt for en bestemt stamme af patogenet). Der kan være behov for flere degenererede sekvenser for at dække de forskellige varianter af stammer af den samme art. En konsekvens af at have en sådan cocktail af primere kan være uspecifik amplifikation i den sene amplifikation.

Multiplexeringsmetoderne for LAMP er mindre udviklede end for PCR. Det større antal primere pr. mål i LAMP øger sandsynligheden for primer-primer-interaktioner for multiplexede målsæt. Produktet af LAMP er en serie af konkatemer af målregionen, hvilket giver anledning til et karakteristisk "ladder"- eller båndmønster på en gel, snarere end et enkelt bånd som ved PCR. Selv om dette ikke er et problem ved påvisning af enkelte mål med LAMP, er "traditionelle" (endpoint) multiplex-PCR-applikationer, hvor identiteten af et mål bekræftes ved hjælp af størrelsen af et bånd på en gel, ikke mulige med LAMP. Multiplexing i LAMP er blevet opnået ved at vælge et målområde med et restriktionssted og ved at fordøje det før kørsel på en gel, således at hvert produkt giver anledning til et fragment af en bestemt størrelse, selv om denne fremgangsmåde gør forsøgsdesignet og protokollen mere kompleks.

Brugen af en DNA-polymerase, der forskyder en streng i LAMP, udelukker også brugen af hydrolyseprober, f.eks. TaqMan-prober, som er afhængige af Taq-polymerasens 5'-3'-exonukleaseaktivitet. Der er blevet rapporteret om en alternativ realtidsmultiplexeringsmetode baseret på fluorescensudslukkere.

Der kan tilsættes SYBR-grønt farvestof for at se LAMP i realtid. I den sene amplifikation kan primer-dimer-amplifikation imidlertid bidrage til et falsk positivt signal. Brugen af uorganisk pyrofosfatase i en SYBR-reaktionsblanding gør det muligt at anvende smelteanalyse til at skelne mellem korrekt amplifikation

Selv om der er blevet foreslået forskellige strategier til afbødning af falsk-positive resultater i assays baseret på denne metode, er uspecifik amplifikation på grund af forskellige faktorer, herunder fraværet af temperatur-gating-mekanismer, en af de største begrænsninger ved loop-medieret isotermisk amplifikation.

Se også

• PCR

Denne side vil blive placeret i følgende kategorier, hvis den bliver flyttet til artikel-navnerummet.

Kategorier:

• Biokemi
• Kloning